Phòng thí nghiệm giữ mẫu sinh học lâu dài bằng hai mức lạnh: tủ âm sâu khoảng −80 °C cho ADN, ARN, protein, chủng vi khuẩn, và bình nitơ lỏng (nitơ sôi ở −196 °C) cho tế bào sống, phôi, tinh trùng cần hồi sinh sau nhiều năm. Lý do nằm ở chỗ dưới khoảng −130 °C, nước trong tế bào gần như "đứng hình", phản ứng hoá học chậm tới mức coi như dừng. Cái khó không phải làm lạnh, mà là làm lạnh và rã đông sao cho tế bào không bị chính nước của nó đâm thủng.
Vì sao lạnh giữ được mẫu
Mẫu sinh học hỏng vì ba thứ: enzyme tự phân huỷ, vi sinh vật ăn mẫu, và các phản ứng hoá học chậm như oxy hoá. Cả ba đều phụ thuộc nhiệt độ. Hạ nhiệt độ là hạ tốc độ của chúng.
Tủ lạnh nhà 4 °C chỉ làm chậm trong vài ngày. Ngăn đá −18 °C giữ thịt được vài tháng, nhưng ở mức này vẫn còn những vùng nước lỏng siêu đặc giữa các tinh thể đá, nơi phản ứng tiếp tục âm thầm. Tới −80 °C, phần nước lỏng ấy gần như biến mất, enzyme gần như ngủ. Dưới khoảng −130 °C, nước còn lại chuyển sang trạng thái thuỷ tinh, không còn chuyển động đủ để phá huỷ gì. Các nhà sinh học cryo hay gọi mức này là "ngưỡng an toàn" cho lưu trữ hàng chục năm.
Bảng các mức lạnh thường gặp
| Mức lạnh | Thiết bị | Giữ cái gì | Giữ được bao lâu (ước chừng) |
|---|---|---|---|
| 2–8 °C | Tủ mát phòng thí nghiệm | Hoá chất, kháng thể đang dùng, vắc xin | Ngày đến vài tháng tuỳ loại |
| −20 °C | Tủ đông thường | Enzyme trong glycerol, mồi PCR, mẫu dùng thường xuyên | Tháng đến vài năm |
| −80 °C | Tủ âm sâu (ULT) | ADN, ARN, protein, huyết thanh, chủng vi khuẩn trong glycerol | Nhiều năm |
| −150 °C đến −190 °C | Pha hơi trên mặt nitơ lỏng | Tế bào sống, mô, phôi, giao tử | Hàng chục năm |
| −196 °C | Ngâm trong nitơ lỏng | Như trên, khi cần lạnh tuyệt đối ổn định | Hàng chục năm |
Thời hạn ở cột cuối chỉ là mức tham khảo. Mỗi loại mẫu, mỗi quy trình có hạn dùng riêng do phòng thí nghiệm tự kiểm chứng.
Tủ âm sâu −80 °C: con ngựa thồ của phòng thí nghiệm
Tủ −80 °C trông như tủ đông cỡ lớn, cửa dày, bên trong chia nhiều ngăn có cửa phụ. Nó dùng hai tầng máy nén nối tiếp (gọi là hệ thống cascade): tầng thứ nhất hạ nhiệt cho tầng thứ hai, tầng thứ hai mới kéo được xuống mức −80 °C. Vì thế tủ tốn điện, toả nhiệt nhiều, và phòng đặt tủ thường phải có điều hoà riêng.
Những thói quen làm nên khác biệt giữa một kho mẫu đáng tin và một kho mẫu "may rủi":
- Chia nhỏ mẫu (aliquot). Mỗi lần rã đông rồi đông lại, ADN đứt thêm, protein biến tính thêm. Chia mẫu gốc thành nhiều ống nhỏ, mỗi lần chỉ lấy một ống.
- Mở cửa nhanh, có sơ đồ. Mở tủ một phút, nhiệt độ trong ngăn có thể vọt lên hàng chục độ. Phòng thí nghiệm tốt có sơ đồ vị trí từng hộp, lấy là biết ngay ở giá nào.
- Báo động và nhật ký nhiệt độ. Tủ có cảm biến báo khi nhiệt độ lên quá ngưỡng, nhiều nơi nối báo động về điện thoại người trực.
- Kế hoạch khi tủ hỏng. Luôn để trống một phần dung tích ở tủ dự phòng, có sẵn đá khô để chuyển mẫu khẩn cấp.
- Xả băng định kỳ. Lớp băng đóng quanh cửa làm hở gioăng, tủ chạy nặng hơn và dễ hỏng.
Mất điện là nỗi lo lớn nhất. Một tủ −80 °C đầy mẫu, cửa đóng kín, thường giữ được dưới −50 °C trong vài giờ, nhưng con số thực tế khác nhau nhiều tuỳ đời tủ và độ đầy. Vì vậy các kho mẫu quan trọng đều có máy phát điện hoặc nguồn dự phòng.
Nitơ lỏng: lạnh nhất mà vẫn rẻ
Nitơ chiếm khoảng 78% không khí. Người ta hoá lỏng nó trong nhà máy tách khí rồi chở tới phòng thí nghiệm bằng bồn cách nhiệt. Ở áp suất thường, nitơ lỏng sôi ở −196 °C, tức 77 K. Nó rẻ, trơ về hoá học và không cháy, nên là lựa chọn tự nhiên cho lưu trữ siêu lạnh.
Mẫu được đựng trong ống nhựa nhỏ có nắp vặn (cryovial) hoặc ống rơm mảnh (straw) trong ngành hỗ trợ sinh sản. Các ống xếp vào giá, hạ vào bình Dewar, là loại bình hai lớp có chân không ở giữa, cùng nguyên lý với phích nước nhưng to hơn nhiều.
Pha lỏng hay pha hơi
Có hai cách giữ trong bình nitơ:
- Pha lỏng: mẫu ngâm hẳn trong nitơ, lạnh đều −196 °C. Nhược điểm là nitơ lỏng có thể thấm vào ống qua nắp không kín, và về lý thuyết có thể mang theo vi sinh vật từ mẫu này sang mẫu khác.
- Pha hơi: mẫu treo phía trên mặt nitơ, trong lớp hơi lạnh khoảng −150 °C đến −190 °C. Giảm nguy cơ nhiễm chéo và nguy cơ ống nổ, nhưng nhiệt độ ở miệng bình cao hơn đáy, phải theo dõi kỹ hơn.
Nhiều kho hiện đại chọn pha hơi cho mẫu y sinh, và bổ sung nitơ tự động qua hệ thống ống từ bồn chứa lớn.
Đóng băng mà không giết tế bào
Nếu thả thẳng một ống tế bào vào nitơ lỏng, phần lớn tế bào sẽ chết. Thủ phạm là tinh thể nước đá. Khi nước đóng băng, tinh thể nhọn có thể đâm rách màng tế bào. Còn khi đá hình thành bên ngoài tế bào, phần nước lỏng còn lại đặc muối dần, kéo nước từ trong tế bào ra, làm tế bào co quắp.
Lời giải đến từ chất bảo vệ lạnh (cryoprotectant). Năm 1949, nhóm của Christopher Polge ở Anh phát hiện glycerol giúp tinh trùng gà sống sót sau đông lạnh, một phát hiện mở đường cho cả ngành. Ngày nay hai chất quen thuộc nhất là glycerol và DMSO (dimethyl sulfoxide). Chúng xen vào giữa các phân tử nước, làm đá khó kết tinh và làm quá trình mất nước diễn ra êm hơn.
Quy trình phổ biến cho tế bào nuôi cấy:
- Trộn tế bào với môi trường có khoảng 5–10% DMSO.
- Hạ nhiệt chậm, thường khoảng 1 °C mỗi phút, bằng máy hạ nhiệt có lập trình hoặc hộp xốp chứa cồn đặt vào tủ −80 °C qua đêm.
- Hôm sau chuyển ống sang bình nitơ lỏng để giữ lâu dài.
- Khi cần dùng, rã đông thật nhanh trong nước ấm khoảng 37 °C rồi pha loãng ngay để loại DMSO.
Câu thần chú trong nghề là "đông chậm, rã nhanh". Rã chậm sẽ cho đá có thời gian kết tinh lại thành hạt to, phá huỷ đúng lúc tế bào yếu nhất.
Phôi và trứng người ngày nay thường dùng kỹ thuật thuỷ tinh hoá (vitrification): nồng độ chất bảo vệ cao, làm lạnh cực nhanh để nước đông thành thể thuỷ tinh mà không kịp tạo tinh thể.
Đá khô: người vận chuyển
Khi cần gửi mẫu −80 °C đi xa, người ta dùng đá khô, tức CO₂ ở thể rắn, nhiệt độ khoảng −78,5 °C. Đá khô thăng hoa thẳng thành khí, không để lại nước. Thùng gửi mẫu phải để thoáng khí, tuyệt đối không đóng kín, vì khí CO₂ sinh ra làm tăng áp suất. Hãng hàng không và dịch vụ chuyển phát xếp đá khô vào nhóm hàng nguy hiểm có quy định riêng về khối lượng và nhãn.
An toàn: nitơ lỏng không phải đồ chơi khói
Nitơ lỏng xuất hiện ngày càng nhiều ngoài phòng thí nghiệm, trong các món kem khói, kẹo "thở ra khói" ở hội chợ. Phần này là kiến thức phổ thông để hiểu vì sao nhân viên phòng thí nghiệm phải được huấn luyện. Không tự mua, tự dùng nitơ lỏng tại nhà.
Ngạt không báo trước
Một lít nitơ lỏng bay hơi thành khoảng 700 lít khí. Trong phòng kín, khí nitơ đẩy oxy ra ngoài. Người hít không khí thiếu oxy không thấy khó thở hay ngột ngạt rõ rệt, vì cảm giác ngạt chủ yếu do CO₂ tích tụ chứ không do thiếu oxy. Họ có thể choáng và ngã rất nhanh. Vì vậy phòng chứa nitơ lỏng có cảm biến oxy và quạt thông gió, và người ta không đi vào thang máy cùng bình nitơ lớn.
Bỏng lạnh
Chạm vào nitơ lỏng hay kim loại vừa ngâm trong đó gây tổn thương giống bỏng. Hiện tượng giọt nitơ lăn trên da mà không gây hại trong tích tắc (hiệu ứng Leidenfrost, do lớp hơi đệm) khiến nhiều người chủ quan. Nhưng nếu nitơ đọng lại trong găng vải, trong giày hay chảy vào tay áo, tổn thương xảy ra rất nhanh. Người làm việc dùng găng chuyên dụng cách nhiệt, tấm che mặt, áo dài tay.
Nổ do áp suất
Nitơ lỏng trong bình kín sẽ bay hơi và tạo áp suất đủ phá vỡ bình. Bình Dewar luôn có nắp thoát hơi, không bao giờ vặn kín. Ống cryovial ngâm trong pha lỏng nếu bị nitơ thấm vào thì khi lấy ra, nitơ giãn nở có thể làm ống bật nắp hoặc vỡ tung. Vì thế người lấy mẫu đeo kính hoặc tấm che mặt.
Nuốt phải
Các cơ quan an toàn thực phẩm ở nhiều nước đã cảnh báo về món ăn có nitơ lỏng chưa bay hơi hết, vì nuốt phải có thể gây tổn thương nặng đường tiêu hoá. Nếu gặp món "khói lạnh", chỉ ăn khi khói đã tan hết, và không cho trẻ nhỏ ăn ngay lúc còn bốc khói.
Góc nhìn hôm nay: kho lạnh là kho dữ liệu
Một tủ −80 °C đầy mẫu có thể là kết quả của mười năm làm việc. Nhiều vụ hỏng tủ trên thế giới đã làm mất những bộ mẫu không thể thu thập lại, như mẫu từ bệnh nhân đã mất hay từ quần thể động vật nay đã biến mất. Bài học nghề nghiệp vì thế giống hệt bài học sao lưu dữ liệu số: chia mẫu, để ở hai nơi, ghi sổ cẩn thận, có người trực.
Muốn xem tận mắt, có thể hỏi các ngày mở cửa phòng thí nghiệm của các viện nghiên cứu, trường đại học y dược, sinh học. Ở Việt Nam, các trung tâm hỗ trợ sinh sản và ngân hàng máu dây rốn cũng dùng bình nitơ lỏng hằng ngày; nhiều nơi có bài giới thiệu quy trình lưu trữ công khai.
Câu hỏi thường gặp
Nitơ lỏng lạnh bao nhiêu độ?
Nitơ lỏng sôi ở −196 °C (77 K) dưới áp suất thường. Lớp hơi ngay trên mặt chất lỏng lạnh khoảng −150 °C đến −190 °C, đủ để giữ tế bào sống trong nhiều thập kỷ.
Tủ âm sâu −80 độ dùng để làm gì?
Tủ −80 °C giữ ADN, ARN, protein, huyết thanh và chủng vi khuẩn trong glycerol trong nhiều năm. Ở mức này hoạt động của enzyme gần như dừng, nhưng muốn giữ tế bào sống lâu dài thì vẫn nên chuyển sang nitơ lỏng.
Vì sao đông lạnh tế bào phải dùng DMSO hay glycerol?
Hai chất này cản nước kết tinh thành đá nhọn và làm quá trình mất nước của tế bào diễn ra từ từ. Không có chúng, phần lớn tế bào sẽ bị tinh thể đá làm rách màng hoặc co rút mà chết.
Nitơ lỏng có nguy hiểm không?
Có, nếu dùng không đúng. Ba nguy cơ chính là ngạt do thiếu oxy trong phòng kín, bỏng lạnh khi chạm vào, và nổ khi đựng trong bình đậy kín. Chỉ người được huấn luyện mới nên thao tác với nitơ lỏng.
Đá khô khác nitơ lỏng thế nào?
Đá khô là CO₂ thể rắn, khoảng −78,5 °C, thăng hoa thẳng thành khí, hợp để vận chuyển mẫu −80 °C. Nitơ lỏng lạnh hơn nhiều (−196 °C) và dùng cho lưu trữ lâu dài; cả hai đều cần chỗ thoáng khí và không được đậy kín.
